分光光度法則

　　分光光度法則是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長(zhǎng)范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū),(2)400～760nm的可見(jiàn)光區(qū),(3)2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度，儀器應(yīng)按照計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進(jìn)行校正檢定。

關(guān)系式

　　單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：

　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc

　　式中 :A 為吸收度；

　　I。為入射的單色光強(qiáng)度；

　　I 為的單色光強(qiáng)度；

　　T 為物質(zhì)的比；

　　k 為吸收系數(shù)；

　　L 為被分析物質(zhì)的光程

　　c 為物質(zhì)的濃度

　　物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收,但可在條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱(chēng)比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。

結(jié)構(gòu)

　　分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。

[編輯本段]分光光度計(jì)的光譜范圍

　　包括波長(zhǎng)范圍為400~760 nm的可見(jiàn)光區(qū)和波長(zhǎng)范圍為200～400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源.

　　鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400～760nm波長(zhǎng)的光譜,光通過(guò)三棱鏡折射后,可得到由紅,橙,黃,綠,藍(lán),靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見(jiàn)光分光光度計(jì)的光源.

　　氫燈（或氘燈）的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185～400 nm波長(zhǎng)的光譜,可作為紫外光光度計(jì)的光源.

　　物質(zhì)的吸收光譜(1)

　　如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線(xiàn),即光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱(chēng)為該溶液的吸收光譜.

　　不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì).

　　物質(zhì)的吸收光譜(2)

　　當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)某種物質(zhì)的溶液時(shí),透過(guò)的光的強(qiáng)度減弱.因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收,只有一部分光可透過(guò)溶液.

　　入射光 = 反射光 + 分 + 吸收光 + 透過(guò)光

　　如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失,則:

　　入射光 = 吸收光 十 透過(guò)光

簡(jiǎn)單原理　　分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。